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1 、实时荧光定量 PCR ( Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ—PCR ) 聚合酶链反应( PCR )技术虽已被广泛应用于核酸分析,但普通 PCR还 存在一些不足: (1)只有定性结果,无法给出临床需要的定量结果; (2)由于采用电泳检测,易引起 PCR 产物的交*污染,增加了假阳性结果的可能性; (3)采用的染色剂溴乙锭是致癌物,可能危害操作人员及污染环境。 为了解决上述问题,建立了定时荧光定量 PCR 方法(Real Time Flourescence quantitative PCR,FQ—PCR) , 其中应用最广泛的是 TaqMan 法。该技术在常规 PCR 基础上,添加了一条标记 2 个荧光基团的荧光双标记探针。一个标记在探针的 5' 端,称为荧光报告基团(R);另一个标记在探针的 3' 端,称为荧光抑制基团(Q)。探针的 3' 羟基(-OH)已被去除或封闭,不具有延伸能力。在探针分子完整的情况下, R 发出的荧光被 Q 淬灭吸收。此时检测不到荧光信号。当特异性 PCR 扩增发生时,探针会在 PCR 过程中被 Taq 酶的 5'--3' 活性作用切断(切口平移效应),抑制作用消失,从而引起报告基团荧光信号的产生。荧光信号伴随 PCR 产物的增长而增长。实时荧光定量 PCR 方法就是利用此原理,在 PCR 过程中,连续不断的检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以 99.7% 的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值)时,此时的循环次数( Ct 值)就被记录下来,该循环参数和 PCR 体系中起始 DNA 量的对数值之间有严格的线性关系,利用阳性梯度标准品的 Ct 值,制成标准曲线,再根据样品的 Ct 值就可以准确定出起始 DNA 的数量。目前用于临床检测的病原体基因诊断试剂绝大部分是此类。 2 、基因芯片( Gene Chip or microarray ) 基因芯片或微阵列是近年发展起来的分子生物学研究工具。在 1 平方厘米的芯片上可以同时分析几百至数万个基因,具有高通量、快速获取有关生物学信息的特点。基因芯片技术事实上是一个小型的反向点杂交系统,将几百至数十万个 cDNA 或寡核苷酸密集排列与固相支持物上,作为探针。把要研究的样品 DNA (称靶 DAN )用荧光标记后与芯片上的探针进行杂交,透过扫描后,对杂交结果进行计算机软件分析,根据杂交信号的强弱和序列即可确定靶 DNA 的表达情况以及突变和多态性的存在。基因芯片的优势在于可以一次检测多种病原微生物,不仅可进行病原微生物种、亚种、型的识别,同时可了解致病菌的致病基因和耐药基因,以及寻找新的病原菌。目前基因芯片主要用于科研,要从实验室研究推向临床应用还有一系列问题需要解决。如提高特异性、简化操作、降低成本等。 3 、其他方法 (1)罗氏公司( Roche Diagnostic Systems, Inc. )发展的 Cobas Amplicor 系统。 (2)转录介导的扩增系统 [Gen-Probe transcription-mediated amplification (TMA ) system ] (3)链接酶链式反应( LCR ) (4)链置换扩增( SDA ) |